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156. 腹膜播種を制御する microRNA の同定とその作用機序の解明 澤田

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156. 腹膜播種を制御する microRNA の同定とその作用機序の解明 澤田
 上原記念生命科学財団研究報告集, 25 (2011)
156. 腹膜播種を制御する microRNA の同定とその作用機序の解明
澤田 健二郎
Key words:腹膜播種,microRNA,インテグリン, 卵巣癌,分子標的治療
大阪大学 大学院医学系研究科
産科学婦人科学教室
緒 言
卵巣癌は最新の抗癌剤治療をもってしても,5 年生存率 40%程度と極めて予後不良である.卵巣癌は卵巣表面の一層の卵巣
上皮から発生し,この卵巣上皮細胞が発癌(Transformation)の後,上皮から離脱,腹腔内を浮遊した後,大網,腹膜を
始めとする諸臓器に付着,転移巣を形成するという他癌と比べて極めて特異的な転移経過を辿る.しかる後,癌細胞が増殖
し,基底膜が破壊され間質内へ浸潤していく.最近,我々は 図 1 に示すように,卵巣癌が上皮細胞としての特性を失う(ECadherin の発現減少)過程で,ファイブロネクチンに対する受容体である Integrin α5 の発現が増強することを発見し,こ
の Integrin α5 は癌細胞の接着能に重要な役割を果たしていることを解明した1).さらに病期 Stage II-IV にある卵巣癌患
者 107 名より作成した組織マイクロアレイを用いた免疫染色により,Integrin α5 の強発現が卵巣癌の予後因子であることを報
告した.以上の検討により,このインテグリンに対する分子標的治療は卵巣癌の腹膜播種制御に対する新たな選択肢になりうる
と考え,その分子レベルでの制御機構についての検討を行うことにした.哺乳類では,ゲノムにコードされる 400 種類以上のマ
イクロ RNA が,時に重複しながら様々な遺伝子の転写翻訳を抑制している.例えば,Peter 等は卵巣を含む 60 種類の癌細
胞株のマイクロ RNA の発現プロファイルを検討し,miR-200 family が E カドヘリンの発現を抑制し,上皮細胞の発癌を制
御している可能性を報告している2).このように,卵巣癌を含む上皮細胞の癌化においてマイクロ RNA が重要な役割を果たし
ていることが予想されているが,卵巣癌の接着能を規定する Integrin α5 の発現を制御するマイクロ RNA については未だ
検討されていない.以上の知見に基づき,Integrin α5 の発現機構をマイクロ RNA に焦点を当てて検討することにし,以下
の実験を行った.
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図 1.提唱する腹膜播種のメカニズム.
方法および結果
研究1.Integrin α5 の発現を制御する可能性のある候補マイクロ RNA (miRNA) の解析
方法: Integrin α5 (gene: ITGA5) の 3'-UTR(非翻訳領域)に結合する可能性のある miRNA を解析ソフトである
Diana-microT (ver. 3) 及び TargetScan を用いて検討した.
結果:図 2 にその結果を示す.Diana-microT では hsa-mir-92a および 92b が miTG Score 29.42 と他に比べて極
めて高い値を示しており,TargetScan においても同様の結果が得られた.よって,hsa-mir-92a および 92b に焦点をあて
て以下の実験を行った.
2
図 2. Integrin α5 を制御する候補マイクロ RNA.
Integrin α5 の発現を制御する可能性のあるマイクロ RNA の標的予測アルゴリズム.
研究2.hsa-mir-92a および 92b の卵巣癌細胞株への強制導入に伴う Integrin α5 の発現の変動の検討
方法:卵巣癌細胞株 SKOV3ip1, CaOV3, A2780 (いずれも漿液性腺癌株) を用いた.2.5 x 105 個を 6 ウェルの培養プレ
ー ト 上 に 撒 き , 翌 日 , hsa-mir-92a の 合 成 前 駆 体 ( Ambion ) を ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン 試 薬 Lipofectamine 2000
(Invitrogen)を用いて,強制導入した.前駆体の最終濃度が 40 nM になるように調整した.陰性コントロールとして,
Scrambled RNA (control miRNA, Ambion)を用いた.48 時間後に,RNA を Trizol(Invitrogen)を用いて回収
し,hsa-mir-92a および Integrin α5 の発現レベルを TaqMan System を用いて,Real Time PCR 法で比較検討し
た.同様に蛋白を抽出し,Integrin α5 の発現を Western Blot 法にて解析した.
結果:図 3A に hsa-mir-92a の TaqMan microRNA assay の結果を示す.hsa-mir-92a の強制導入により,卵巣癌
細胞における hsa-mir-92a の発現は 30 ~ 380 倍に有意に増加した.図 3B に強制導入に伴う Integrin α5 の mRNA
レベルでの発現を Real-tome RT-PCR 法で検討した.卵巣癌細胞株における Integrin α5 の発現は 38 ~ 54%と約半
分に抑制された.この結果を Western Blot 法にて確認した.図 3C に示した通り,hsa-mir-92a 強制導入は Integrin
α5 の発現を抑制した.同様の検討を hsa-mir-92b の前駆体を用いて行ったが,Integrin α5 の発現に影響を与えなかっ
た(Data Not Shown).
以上より,卵巣癌細胞株において,hsa-mir-92a の強制導入は Integrin α5 の発現レベルを有意に減少させることが判明し
た.
3
図 3. hsa-mir-92a の卵巣癌細胞株への強制導入は Integrin α5 の発現を抑制する.
A. TaqMan MicroRNA assays. 卵巣癌細胞株 SKOV3ip1, CaOV3, A2780 に対して,hsa-mir-92a の合成前
駆体 (40 nM, Ambion) を強制導入した.陰性コントロールとして,Scrambled RNA (control miRNA) を用い
た.48 時間後に RNA を回収し,hsa-mir-92a の発現レベルを TaqMan MicroRNA assays で解析した.
B. Real Time RT-PCR 法.A で回収した RNA における Integrin α5 の mRNA の発現レベルを Real Time
PCR 法で比較検討した.
C. Western Blot 法.Integrin α5 の蛋白レベルでの発現を解析した.(**; P<0.01, vs control miRNA , ***;
P<0.001, vs control miRNA)
研究3.各種卵巣癌細胞株における Integrin α5 と,hsa-mir-92a との発現の相関関係の検討
方法:6 種の卵巣癌細胞株(CaOV3, OVISE, A2780, SKOV3ip1; 漿液性腺癌株,RMUG-S;粘液性腺癌株,
RMG-1;明細胞腺癌株)を用いた.これらの蛋白及び RNA を抽出し,Western Blot 法にて,Integrin α5 の発現を,
miRNA Real Time PCR 法で hsa-mir-92a の発現を検討した.Western Blot 法の内部コントロールには actin を用
い,PCR 法の内部コントロールには RNU6B を用いた.
結果:図 4A に示した通り,6 種中,RMUG-S を除く 5 種の細胞株で Integrin α5 が強く発現していた.そこで,RMUGS における hsa-mir-92a の発現レベルを 1 として,他の細胞株における hsa-mir-92a の発現を検討したところ,0.002
~ 0.079 と著明に発現が低下していた(図 4B).
以上より,これら卵巣癌細胞株においては,hsa-mir-92a が Integrin α5 の発現を制御している可能性が示唆された.
4
図 4. 各種卵巣癌細胞株における Integrin α5 と hsa-mir-92a の相関関係.
A. Western Blot 法.6 種の卵巣癌細胞株の蛋白を抽出し,15 mg を SDS-PAGE に電気泳動.PVDF メンブ
レンに転写後,抗 Integrin α5 抗体で標識した.コントロールとして,actin を用いた.
B. TaqMan MicroRNA assays. Integrin α5 低発現 株 RMUG-S における hsa-mir-92a の相対的な発現量
を表示.
C. Integrin α5 と hsa-mir-92a の発現量の相関係数及び回帰分析.
研究4.Integrin α5 低発現細胞株における hsa-mir-92a 抑制効果の検討
方法:Integrin α5 が殆ど発現していない卵巣癌細胞株 RMUG-S を 2.5x105 個を 6 ウェルの培養プレート上に撒き,翌
日,hsa-mir-92a の阻害剤(Ambion)をトランスフェクション試薬 Lipofectamine 2000(Invitrogen)を用いて,強制
導入し,hsa-mir-92a の発現を抑制した.48 時間後に mRNA 及び蛋白を回収し,Integrin α5 の発現に与える影響を
検証した.
結果:図 5A に示した通り,阻害剤の導入により hsa-mir-92a の発現は 0.16%と有意に抑制された.hsa-mir-92a の発
現抑制により,Integrin α5 の発現は 3.95 倍に有意に増加した(図 5B).その結果を Western Blot 法にて蛋白レベルで
も確認した(図 5C).
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図 5. hsa-mir-92a の阻害剤は RMUG-S 細胞における Integrin α5 の発現を増加させる.
A. TaqMan MicroRNA assays. 卵巣癌細胞株 RMUG-S に対して,hsa-mir-92a の阻害剤 (40 nM, Ambion)
を強制導入した.陰性コントロールとして,Scrambled RNA (control miRNA) を用いた.48 時間後に RNA を回
収し,hsa-mir-92a の発現レベルを TaqMan MicroRNA assays で解析した.
B. Real Time RT-PCR 法.A で回収した RNA における Integrin α5 の mRNA の発現レベルを Real Time
PCR 法で比較検討した.
C. Western Blot 法. Integrin α5 の蛋白レベルでの発現を解析した(***; P<0.001, vs control miRNA).
研究5.hsa-mir-92a の強制導入が卵巣癌の接着能に充てる影響の解析
方法:卵巣癌細胞株 2.5 x 105 個を 6 ウェルの培養プレート上に撒き,翌日,hsa-mir-92a の合成前駆体(Ambion)を
トランスフェクション試薬 Lipofectamine 2000(Invitrogen)を用いて,強制導入した.陰性コントロールとして,Scrambled
RNA(control miRNA, Ambion)を用いた.48 時間後に細胞を回収し,無血清培養液中に再懸濁した.続いて,5 x
104 個の細胞を Fibronectin (50μg/ml) でコートした 96 ウェルに撒き,一時間培養した後,ウェルを PBS で 3 回洗浄し,
固定後,ギムザ染色で接着細胞を染色した.しかる後に 560 nm の吸光度を測定し,control miRNA 導入時の接着細胞
数を 1 とした時の接着細胞数を比較検討した.
結果:図 6 に示した通り,hsa-mir-92a の強制導入により,卵巣癌細胞株の Fibronectin への接着がそれぞれ 44%
(SKOV3ip1),82%(A2780)と有意に抑制された.即ち,hsa-mir-92a の強制導入により,卵巣癌細胞の細胞外マトリッ
クスへの接着能が抑制できる可能性が示唆された.
6
図 6. In Vitro Adhesion Assay.
卵巣癌細胞株に hsa-mir-92a の合成前駆体を強制導入し,48 時間後に細胞を回収し,無血清培養液中に再懸濁
した.しかる後,5 x 104 個の細胞を Fibronectin (50μg/ml) でコートした 96 ウェルに撒き,一時間培養した後,
ウェルを PBS で 3 回洗浄し,固定後,ギムザ染色で接着細胞を染色した.しかる後に 560 nm の吸光度を測定
し,control miRNA 導入時の接着細胞数を 1 とした時の接着細胞数を比較検討した.(**; P<0.01, vs control
miRNA, ***; P<0.001, vs control miRNA).
研究6.hsa-mir-92a の強制導入が卵巣癌の浸潤能に充てる影響の解析
方法:卵巣癌細胞株 2.5 x 105 個を 6 ウェルの培養プレート上に撒き,翌日,hsa-mir-92a の合成前駆体(Ambion)を
トランスフェクション試薬 Lipofectamine 2000(Invitrogen)を用いて,強制導入した.陰性コントロールとして,Scrambled
RNA(control miRNA, Ambion)を用いた.48 時間後に細胞を回収し,無血清培養液中に再懸濁した.続いて,1 x
105 個の細胞を Matrigel (25μg/ml) でコートした 24 ウェルの Boyden Chamber の上層に撒き,下層に 10%FBS 入培養
液を入れ,癌細胞の浸潤を誘導した.48 時間培養した後,chamber を PBS で 3 回洗浄し,上層に残っている細胞を綿棒
で丁寧に取り除き,固定後,下層に浸潤した細胞をギムザ染色した.しかる後に chamber を 200 倍視野で無作為に 10 か
所撮影し,浸潤細胞数を目視でカウントし,control miRNA 導入時の浸潤細胞数を 1 として,比較検討した.
結果:図 7 に示した通り,hsa-mir-92a の強制導入により,卵巣癌細胞株の浸潤能がそれぞれ 77%(SKOV3ip1)
,87%
(A2780)と有意に抑制した.即ち,hsa-mir-92a の強制導入により,卵巣癌の細胞外マトリックスへの浸潤が抑制できる可
能性が示唆された.
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図 7. In vitro Invasion Assay.
卵巣癌細胞株に hsa-mir-92a の合成前駆体を強制導入し,48 時間後に細胞を回収し,無血清培養液中に再懸濁
した.しかる後,1 x 105 個の細胞を Matrigel (25μg/ml) でコートした 24 ウェルの Boyden Chamber の上層に撒
き,癌細胞の浸潤を誘導した.48 時間培養した後,下層に浸潤した細胞をギムザ染色した.浸潤細胞数を目視でカ
ウントし,control miRNA 導入時の浸潤細胞数を 1 として,比較検討した (**; P<0.01, vs control miRNA, ***;
P<0.001, vs control miRNA).
考 察
我々は以前より,卵巣癌腹膜播種に重要な役割を果たしている接着因子は Integrin α5 であることを報告しており,今回の研
究では,このインテグリンの転写発現を制御するマイクロ RNA を検討し,以上報告したとおり,hsa-mir-92a を候補マイク
ロ RNA として,抽出した.
まず,各種卵巣癌細胞株における hsa-mir-92a の発現を Taqman probe を用いた Real-time PCR 法で検討したとこ
ろ,Integrin α5 の蛋白レベルでの発現が殆どない卵巣癌細胞株 RMUG-S でその発現が他の卵巣癌細胞株(SKOV3ip1, A2780, OVISE, RMG-1) に比べて,著明に増加していた.更に,Integrin α5 が強発現している SKOV3ip1 及
び A2780 に hsa-mir-92a の前駆体を強制導入したところ,両細胞株において,Integrin α5 の発現が約 50%に低下し
た.さらに Integrin α5 の基質である細胞外マトリックス,ファイブロネクチンへの接着能を有意に低下し,それに伴い,癌細
胞の浸潤能も低下した.
このように,マイクロ RNA, hsa-mir-92a が卵巣癌細胞株において,Integrin α5 の転写発現を制御することにより,癌細
胞の接着能,浸潤能を抑制することが判明した.近年,癌をはじめとする様々な疾患と マイクロ RNA との関連性が強く指摘
されている.これまで疾患の原因の主役であると考えられてきたタンパク質ではなく,それらタンパク質の発現を緻密にコントロー
ルする マイクロ RNA こそが,疾患の「真の支配者」であるという新概念も生まれてきている.その意味でマイクロ RNA 研究
は癌の基礎医学を刷新する重要な発見であり,癌の理解と診断において新たな歴史を開く可能性を有している.特にバイオマ
ーカーとしてのマイクロ RNA の発現解析は,実験系が非常に安定化しているため,今後急速な臨床応用が期待されてい
る.治療への応用に関しても,世界中で活発に検討がなされており,マイクロ RNA にコレステロールを付加して安定化させた
ものの投与実験や核酸試薬そのものの開発試験などが近年報告されている.しかしながら,現時点で臨床応用されているもの
はなく,今後の大きな発展性を有した分野である.
今後は ① ヒト臨床卵巣癌検体を用いて,卵巣癌原発巣,転移巣における hsa-mir-92a の発現を検討し,Integrin α5
の発現との相関,及び予後に与える影響を検討し,② hsa-mir-92a の配列をベクターに組み込んだ Lentivirus を作成
8
し,ヒト卵巣癌腹膜播種モデルマウスへの投与実験を行うことにより,腹膜播種のバイオマーカーとしての hsa-mir-92a の意
義の検定及び,このマイクロ RNA を標的とした分子治療の可能性を検討していきたい.
文 献
1) Sawada, K., Mitra, A. K., Radjabi, A. R., Bhaskar, V., Kistner, E. O., Tretiakova, M., Jagadeeswaran,
S., Montag, A., Becker, A., Kenny, H.A., Peter, M. E., Ramakrishnan, V., Yamada, S. D. & Lengyel,
E.:Loss of E-cadherin promotes ovarian cancer metastasis via α 5-integrin, which is a therapeutic
target. Cancer Res. 68:2329-2339, 2008.
2) Park, S. M., Gaur, A. B., Lengyel, E. & Peter, M. E.:The miR-200 family determines the epithelial
phenotype of cancer cells by targeting the E-cadherin repressors ZEB1 and ZEB2. Genes Dev., 22 :
894-907, 2008.
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