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PROTOCOL CORNER:平滑末端クローニング

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PROTOCOL CORNER:平滑末端クローニング
No.86.qx 07.4.13 14:18 ページ 6
平滑末端クローニング
知っているようで、少し自信がない。本コーナーでは、そのようなプロトコールを詳しく解説いたします。
はじめ に
法です。以下に方法をご紹介します。
最近、KOD DNA polymeraseなどの平滑末端を生じる高正確
性酵素を用いて増幅を行う機会が増え、平滑末端クローニングを行
(1)制限酵素処理
う回数も多くなっているのではないでしょうか? 今回は、
そのよう
1∼5μgのベクターを、制限酵素を用いて完全消化します。
な平滑末端を有するDNA断片のクローニング方法および周辺技術
このとき、切れ残りがあると、クローニングの効率が低下します
について詳しく解説いたします。
ので、電気泳動で切れ残りが確認できなくなるまで念入りに消
化します。精製時のロスを考えて少し多めのベクターでスタ
今回説明する作業を以下のように図式化しました。ここでは、
主に
ートすることをお薦めします。
このフロー図に沿って説明いたします。
(2)精製
アルカリホスファターゼ処理を確実に行うために精製*を行
います。精製後、DNAを80μlの滅菌水中に溶出(溶解)してく
ださい。
*精製には、磁性ビーズを利用したDNAフラグメント精製キッ
ト「MagExtractor TM -PCR & Gel Clean up-( Code
No.:NPK-601)」が便利です。
(3)アルカリホスファターゼ処理(脱リン酸化処理)
精製DNA溶液(0.5∼2.5μg)
10×Buffer
*
E.
coli Alkaline Phosphatase(0.1∼1U/μl)
Total
↓
平滑末端、3'突出末端 → 60℃, 60min
5'突出末端 → 37℃, 60min 80(μl)
10
10
100μl
*目安として5∼20pmolesの5'末端に対して2Uですが、添加
できる最大量(最終液量の10%)
を添加することでほとんど
の場合、問題なく脱リン酸化できます。
(4)アルカリホスファターゼ処理後のベクターの精製
〈この精製は必ず行ってください〉
図1.平滑末端クローニングのフロー
酵素が残留すると以下の実験に大きな影響を及ぼします。
実験書などではフェノール/クロロホルム処理が必要である
と書かれていますが、MagExtractorTM -PCR & Gel Clean
方 法
up-*を用いると簡単に精製可能です。
1.
ベクターの脱リン酸化
【E. coli Alkaline Phosphatase(Code No.:BAP-111)】
*実験のコツを「私にもできた! ライフサイエンス実験シリーズ
Vol.1」に紹介しています:弊社ウェブサイトwww.toyobo.co.jp
平滑末端サイトを用いてDNA断片をクローニングする場合、ベ
/bioの「実験お助けコーナー」でご覧いただけます。
クターがセルフライゲーションしないようにベクターを脱リン酸
2.
リン酸化PCR産物の調製
化して使用することが一般的です。制限酵素で消化したDNAの
【T4 polynucleotide kinase(Code No.:PNK-111),
5'末端にはリン酸基が残っており、
リン酸基を除去することでラ
rATP(Code No.:ATP-111)
】
イゲーションされなくなります。
以下に、E. coli Alkaline Phosphataseを用いるプロトコー
一般的にPCRに用いられているプライマーの5'末端はリン酸
ルを示します。この酵素は耐熱性が高く容易に失活しないため、
化されていません。よって、KOD -Plus-などの平滑末端PCR産
反応後の精製が必要ですが、手間を惜しまなければ最も確実な方
6
86
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物*は、そのままでは脱リン酸化処理したベクターにはクローニ
高効率ライゲーションキット:Ligation highも含まれており便利
ングすることができません。ここでは、プライマーをあらかじめリ
です。ブランティングのプロトコールは以下のとおりです。
ン酸化しておいてPCRを行う方法と、PCR産物をリン酸化する
DNA溶液
10×Blunting Buffer
KOD(2.5U/μl)
滅菌水
Total
↓
72℃、2min
方法をご紹介します。
*3'-5'エキソヌクレアーゼ活性(校正活性)を有する高正確性
酵素で増幅したDNA断片の末端は平滑化されています。
●リン酸化プライマーを用いる場合
(1)50pmole/μl(μM)以上のPrimer溶液を準備します。
(2)以下のように混合、反応させます。
X(μl)
1
1
8-X
10μl
4.
TAクローニング
【TArget CloneTM -Plus-(Code No.:TAK-201)
】
Primer(50pmole/μl[50μM])
14(μl)
10×Protruding End Kinase Buffer*1
2
10mM rATP*2
2
*3
T4 Polynucleotide Kinase(5∼20U/μl)
2
Total
20μl
↓
37℃、1h反応
↓
95℃、5min(T4 Polynucleotide Kinaseを失活)
↓ ← 50μl 滅菌ミリQ水を添加
10pmole/μl[10μM]primer溶液として使用します*4*5
↓
高正確性酵素を用いてPCRを行います
KOD -Plus-やKOD FXなどの高正確性PCR酵素で増幅した
DNA断片は、そのままではTAクローニングすることができませ
んが、TArget CloneTM -Plus-を用いることで、高効率にTAクロ
ーニングすることが可能です。原理を図2に示します。抗KOD
DNA polymerase抗体でKOD DNA polymeraseの3'−5'エ
キソヌクレアーゼ活性を抑えておき、Taq DNA polymeraseの
TdT活性によってPCR産物にdAを付加して、そのままTベクター
に連結することができます。
*1 T4 Polynucleotide kinaseに添付されています。
*2 別途準備する必要があります。
*3 Kinaseは添加できる最大量を添加します(最終液量の10%)。
*4 このままPCR反応に使用します。
*5 凍結して何度でも使用可能です。
●PCR産物をリン酸化する場合
(1)高正確性PCR酵素で増幅したPCR産物を精製します。
(2)以下のように混合、反応させます。
精製PCR産物(∼1μg)
10×Blunt End Kinase Buffer*1
10mM rATP*2
*3
T4 Polynucleotide Kinase(5∼20U/μl)
Total
↓
37℃、1h反応
↓
精 製*4
35(μl)
5
5
5
50μl
図2.TArget CloneTM -Plus-を用いたKOD PCR産物のTAクローニング
PCR産物
10×A-attachment Mix*
*1 T4 Polynucleotide kinaseに添付されています。
*2 別途準備する必要があります。
*3 Kinaseは添加できる最大量を添加します(最終液量の10%)。
*4 MagExtractorTM -PCR & Gel Clean up-(Code No. NPK601)
を用いることができます。
→ 60℃, 10min
*Taq DNA polymeraseと抗KOD抗体が含まれます。
DW
2×Ligation Buffer
pTA2 Vector
上記反応物
T4 DNA Ligase
3.
DNA断片のブランティング(平滑化)
【Blunting high(Code No.:BLK-101)
】
Blunting highは高効率なブランティングキットです。本キッ
トに用いられているKOD DNA polymeraseは、3'突出部分を
→ 室温, 30min → 形質転換
削り、5'突出部分を埋める活性を有しています。このキットには、
86
9(μl)
1
7
(3-X)
(μl)
5
1
X
1
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5.
方向性の確認
【Blend Taq®(Code No.BTQ-101)
】
D.W.
10×Buffer for Blend Taq®
2mM dNTPs
Forward primer(10pmole/μl)
Reverse primer(10pmole/μl)
Blend Taq®
Total
平滑末端クローニングやTAクローニングを行った場合、DNA
が両方向に挿入されるため、方向性の確認が必要です。インサー
トの確認は通常、ベクター上に設計したプライマーを用いるコロ
ニーダイレクトPCRなどによって確認しますが、その方法ではイ
ンサートの有無だけのチェックしかできません。片方をベクター
21.9(μl)
3
3
0.9
0.9
0.3
30 μl
上、もう片方をインサート上に設計したプライマーを用いるPCR
を行うことによって、インサートの有無と同時に方向性を確認す
ることが可能です。以下に、Blend Taq®を用いるコロニーダイレ
クトPCRの例をお示しします。Blend Taq®はコストパフォーマン
スに優れた高性能PCR酵素であり、KOD Dash®とともにコロニ
ーダイレクトPCRに適している酵素です。
図5に、TAクローニング後にコロニーダイレクトPCRによって
インサートの方向性を確認した例をご紹介します。F1-R2、およ
びF1-F2の組み合わせにおいて、インサートの方向性に依存して
増幅が認められます(それぞれ相補的な関係になっています)。こ
の方法を用いることで、インサートチェックの段階でクローンを絞
り込むことができ、その後の解析をよりスムーズに進めることが
できます。
図3.PCRによる方向性の確認
ベクター、およびインサート上に設計したプライマーを用いてPCRを行い
ます。aもしくはbの組み合わせで得られる増幅パターンより方向性を確認
できます。
図5.コロニーダイレクトPCRの一例
0.5kbのPCRプロダクトをTAクローニングした後、図3に示した様々なプライ
マーの組み合わせを用いてコロニーダイレクトPCRを行いました。
(R1はベ
クター上に設計したリバースプライマー)
M:100bpラダーマーカー
1∼5:各コロニー
おわりに
今回は両方が平滑末端のDNA断片のクローニング方法を中心
に解説しましたが、片方が平滑末端で、もう一方が付着末端の場合
の便利なクローニング方法を「私にもできた! ライフサイエンス実
験シリーズVol.1 」に詳しく紹介しています( 弊社ウェブサイト
[www.toyobo.co.jp/bio]の「実験お助けコーナー」でご覧いただ
けます)。この方法で連結した場合、どこにNickができるかなども一
度頭の中でシュミレーションしてみてはいかがでしょうか。このシ
リーズでは、日常の実験に役立つ様々なプロトコールを紹介させて
いただく予定です。
図4.コロニーダイレクト PCRの操作フロー
8
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より長く、
Flexib
品
名
包 装
保存温度
Code No.
価 格
100U×1本
-20℃
BAP-111
¥15,000
200回用
室温
NPK-601
¥25,000
1個
室温
MGS-101
¥38,000
1,500U×1本
-20℃
PNK-111
¥15,000
50μmoles/0.5ml
-20℃
ATP-111
¥15,000
20回用
-20℃
BLK-101
¥25,000
10回用
-20℃
TAK-201
¥16,000
375μl×2本
-20℃
LGK-101
¥20,000
750μl×1本
-20℃
LGK-201
¥22,000
250U×1本
-20℃
BTQ-101
¥19,000
250U×1本
-20℃
LDP-101
¥25,000
100回用
-20℃
PIK-151
¥29,000
100回用
-20℃
PIK-251
¥31,000
200U×1本
-20℃
KOD-201
¥30,000
200U×1本
-20℃
KOD-211
¥32,000
-20℃
KFX-101
¥35,000
脱リン酸化酵素
E. coli Alkaline Phosphatase
高効率DNA断片精製キット
MagExtractorTM -PCR & Gel Clean up磁性スタンド
Magical Trapper
リン酸化酵素
T4 Polynucleotide Kinase
rATP
高効率平滑化+Ligation
Blunting high
KOD PCRプロダクトのTAクローニング
TArget CloneTM -Plus高効率ライゲーションキット
Ligation high
TAクローニング効率をさらにアップ。-20℃で凍結しません。
Ligation high Ver.2
(本誌p.5)
高性能Taqポリメラーゼ
Blend Taq®
高効率ポリメラーゼ
KOD Dash®
高効率コロニーダイレクトPCR試薬
InsertCheck -Ready-(プライマーフリー)
高効率コロニーダイレクトPCR試薬(色素混合タイプ)
InsertCheck -Ready- Blue(プライマーフリー)
平滑末端を生じる代表的な高正確性ポリメラーゼ
KOD -PlusKOD -Plus- Ver.2
KOD FX
(本誌p.10)
200U×1本
過去に紹介した記事で、今号に関連のある記事をピックアップしてご紹介するコーナーです。
『ACP & MCP-tag』(本誌p.17-18掲載)
ACP/MCP-tagは、ACP/SFP synthase存在下、蛍光標識されたCoA誘
膜タンパク質といえば、最近、膜タンパク質間での相互作用解析の研究が盛ん
導体に共有結合するユニークな約8kDaのタグです。膜タンパク質の細胞外ド
です。Dualsystems社(http://www.dualsystems.com/)では、スプリッ
メインなどとの融合タンパク質として発現させることにより、膜タンパク質を特
トユビキチンシステムを用いた、膜タンパク質間相互作用を検出できるユニー
異的に蛍光パルスラベルすることができます。
クなYeast two-hybrid systemを販売しています(『DUALmembrane
system』)。
このタグを開発したCovalys社(http://www.covalys.com/)は、この他
にも様々な性質を有するユニークなタグを開発しています。
『SNAP-tagTM』
は約20kDaのタグであり、ベンジルグアニン誘導体を基質として共有結合する
興味のある方は、弊社のwebサイト(http://www.toyobo.co.jp/bio)のサ
性質を有しています。ACP-tagに比べサイズは若干大きいですが、タグ自身が
イト内検索に、
「 SNAP」
「DUALmembrane」と入力してみてください。詳細
酵素活性を有するため、様々な用途に使用可能です。
情報をご確認いただけます。
TOYOBO
高正確、高効率
PCRで
応用可能
高正
をし
高効
PCR
S: Best, A: Ex
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9
Fly UP