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尿酸の傍細胞輸送の調節機構と高尿酸血症・痛風治療薬の

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尿酸の傍細胞輸送の調節機構と高尿酸血症・痛風治療薬の
報 告
尿酸の傍細胞輸送の調節機構と高尿酸血症・痛風治療薬の創製
木 村 徹
杏林大学医学部薬理学
【背景と目的】
(2)タイトジャンクションの形成
トランスウェル上に細胞をコンフルエントになるまで培
尿酸は,ヒトにおいてアデノシンやグアノシンといった
養し,transepithelial electrical resistance(TER)の測定
プリン体の最終代謝産物である。この尿酸の代謝経路はヒ
と分子量 3,000 の蛍光デキストランの透過性で評価した。
トおよびその近縁の類人猿に特有のものであり,他の種に
(3)尿酸の paracellular 輸送
おいては,尿酸は尿酸酸化酵素(ユリケース)によって開
トランスポーターの働かない 4℃条件下において,放射
裂を受け代謝される。したがって,ヒトでは血清尿酸値が
ラベルされた尿酸のトランスウェル上下間の輸送を測定し
高値を示し,尿酸の排泄低下や産生亢進によって高尿酸血
た。
症を発症する。よって,生体内における尿酸の排泄・再吸
(4)claudin の同定
収を行うシステムの機能解析が重要である。上皮細胞は腎
細胞の膜画分を調製し,質量分析計を用いて,発現して
臓の尿細管や腸管上皮を形成する外界と接している細胞で
いる claudin 分子の同定を行った。
あり,タイトジャンクションによって管腔側と血管側が隔
てられている。また,胎盤においては,母体血と胎児血と
のバリアー機能を有しているものが胎盤上皮細胞になる。
【結果・考察】
(1)タイトジャンクションの形成
尿酸の pKa は 5.75 であり,生理的条件下ではそのほとんど
タイトジャンクションの形成を TER の測定で検討した。
が陰イオンの形をとっている。上皮細胞を横切った電解質
その結果,細胞が存在しない状態ではトランスウェル上下
の輸送にはいくつかのルートがある。トランスポーターや
間の抵抗値が 150 Ω前後,タイトジャンクションを形成し
チャネルを介する transcellular ルートや,エンドサイトー
ない COS 細胞では約 200 Ωを示した。これに対しタイト
シス/エキソサイトーシスを介したベシクル輸送,そして
ジャンクションを形成すると考えられる胎盤上皮由来細胞
細胞と細胞の間を通る傍細胞
(paracellular)ルートである。
の BeWo,JEG-3 細胞や,腎臓の近位尿細管由来とされる
これまでの腎臓や消化管での尿酸輸送の解析は,トランス
MDCK typeII,LLC-PK1 細胞では 300 Ω前後の TER の上
ポーターを介したトランスセラー輸送がほとんどであっ
昇が確認できた。また,腎臓の遠位尿細管由来とされる
た。そこで本研究では,上皮細胞を用いた尿酸の傍細胞輸
MDCK typeI や腸管由来の Caco-2 細胞では 1000 Ω以上の
送およびそれに関与するであろう claudin について検討を
高い TER が観察された。
行った。
次にタイトジャンクションの形成を分子量 3000 の蛍光
【材料・方法】
(1)使用した上皮由来細胞
デキストランの透過性で評価した。細胞をトランスウェル
上にコンフルエントになるまで培養し,4℃にて上部に蛍
光デキストランを添加し,一定時間後に下部の溶液の蛍光
胎盤絨毛上皮由来細胞として,BeWo 細胞,JEG-3 細胞,
強度を測定することでその透過性を検討した。タイトジャ
腎臓上皮由来細胞として,MDCK 細胞,LLC-PK1 細胞,
ンクションを形成しない COS 細胞や ARPE 細胞では時間
腸管上皮由来細胞として 2 種類の Caco-2 細胞を用いた。
経過ごとに蛍光デキストリンが下部に漏れ出していた。こ
れに対して,TER の上昇も見られた,タイトジャンクショ
平成 27 年度 医学部研究奨励賞 研究成果まとめ
s28
木 村 徹
杏林医会誌 47 巻 3 号
ンを形成する上皮由来細胞ではほとんど蛍光デキストリン
claudin 1,3,4,6,7,12 を発現していた。しかしながら,
が透過していないことを確認した。そこでこの条件下で尿
これらの claudin を尿酸の paracellular 輸送が見られない
酸のパラセルラー輸送の検討を行った。
MDCK 細胞に過剰発現させても,尿酸の輸送に変化は見
(2)尿酸の paracellular 輸送(図 1)
胎盤上皮由来の BeWo 細胞や JEG-3 細胞では 4℃条件下
られなかった。よって,claudin 以外の分子が関与してい
ることが考えられ,現在検討を行っている。
でも,上下間での尿酸輸送が確認されたことから,尿酸が
パラセルラー経路で輸送されていることが示唆された。同
様に腎臓上皮由来細胞の MDCK,LLC-PK1 細胞に関して
検討を行った結果,腎臓由来細胞では 4℃条件下では尿酸
をほとんど輸送しなかった。また,由来の異なる 2 種類の
腸管上皮細胞,Caco-2 細胞に関して検討を行った結果,
尿酸をパラセルラーでよく輸送するセルラインとほとんど
輸送しないセルラインが存在することが分かった。これら
の結果から,尿酸の上皮輸送は,腎臓では transcellular 経
路,胎盤では paracellular 経路,腸管では両者が混在して
いると考えられた。
(3)発現する claudin の同定
上皮細胞におけるイオンの paracellular 輸送に関与する
ものが claudin 分子である。尿酸も生体内ではイオンの形
をとるため,claudin が重要であると考えられた。そこで,
尿酸の paracellular 輸送が見られた BeWo 細胞,Caco-2 細
胞における claudin 分子種の同定を質量分析計を用いて解
析 し た。 そ の 結 果,BeWo 細 胞,Caco-2 細 胞 は 共 に
BeWo
JEG-3
MDCK-I
MDCK-II
LLC-PK1
Caco-2(A) Caco-2(B)
図 1 各細胞モノレイヤーの尿酸の paracellular 輸送
トランスウェル上に細胞をコンフルエントになるまで培養し、トランスポーター
の働かない 4℃条件下において、放射ラベルされた尿酸のトランスウェル上下間
の輸送を測定した。
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